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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-05-08  来源:上海抚生实业有限公司
核心提示:elisa试剂盒中hrp底物范围较广,hrp即辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以z

elisa试剂盒中hrp底物范围较广,hrp即辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以zui 常用。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分,对试剂盒的质量有重要影响。hrp底物主要包括二氨基联苯胺(dab)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

一、二氨基联苯胺/金属盐

dab是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物,在水和醇中不溶解。多数情况下,推荐在dab中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中,辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色,且在水及醇中稳定。dab/金属盐染色应用的组织染色范围较广。

1.需要的溶液和特殊设备

dab,0.05 mol/ltris缓冲液(ph7.6), 0.3% (w/v) 氯化镍/水贮存液, 30%过氧化氢, dpx, 光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.操作步骤

(1) 用 9 ml 0.05 mol/l tris缓冲液(ph7.6)溶解6 mg dab;

(2) 加 l ml 0.3%(w/v)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代);

(3) 加0.1 ml 3%过氧化氢。过氧化氢一般以30%的溶液提供,贮存在4 ℃,此条件可以持续1个月;

(4) 如果出现沉淀,用滤纸过滤;

(5) 加此溶液至标本,并孵育1~20 min水洗终止反应;

(6) 优化:如果需要可复染;

(7) 用dpx封片。

二、氯萘酚

氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。敏感性低于dab,且产物可溶于醇中。它适用于当dab反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。

1.需要的溶液和特殊设备

0.03%氯萘酚,用无水乙醇溶解(贮存在-20℃),0.05 mol/ltris(ph7.6),过氧化氢,gelvatol或者mowiol,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.操作步骤

(1) 氯萘酚贮存液的准备:用10 ml无水乙醇溶解0.3 g氯萘酚,贮存于-20℃;

(2) 加100 μl 氯萘酚贮存液至10 ml 0.05 mol/ltris(ph7.6);

(3) 加0.1 ml 3%过氧化氢于水中。过氧化氢一般是以30%的溶液提供,4℃可存放1个月;

(4) 白色沉淀可用滤纸过滤去除;

(5) 加此溶液到标本中,并在室温孵育10~40 min,水洗终止反应;

(6) 优化:如果需要,进行复染,但只可使用水溶性染料;

(7) 用gelvatol或者mowiol封片。

三、氨乙基咔唑

氨乙基咔唑(aec)产生红色产物,其敏感性低于dab,但可用于dab反应产生较高背景或要求改变产物颜色的实验。此产物可溶于醇,但不溶于水。

1.需要的溶液和特殊设备

0.4% aec用 n,n—二甲基甲酰胺(dmf)溶解, 0.1 mol/l乙酸钠缓冲液(ph5.2),过氧化氢, gelvatol或mowiol,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.操作步骤

(1) 用 l ml dmf溶解 4 mg aec。aec在dmf中稳定,因此,可以用100 ml dmf溶解0.4 g aec作为贮存液备用;

(2) 加 l ml aec溶液至15 ml 0.1 mol/l的乙酸钠缓冲液(ph5.2)中,并搅拌;

(3) 加0.15 ml 3%过氧化氢于水中。过氧化氢一般是30%的溶液提供,在4℃可存放1个月;

(4) 用滤纸过滤;

(5) 加此溶液到标本中,并于室温孵育10~40 min,水洗终止反应;

(6) 优化:如果需要复染,只可用水溶性染料;

(7) 用gelvatol或mowiol封片。

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编辑:songjiajie2010

 
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