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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-03-18  来源:公众号gene diagnosis
核心提示:凡是需要做分子生物学实验的lab,肯定逃不了要买一台核酸定量的机器。目前最为流行的仪器是nanodrop,只需滴加一两微升的样品,按

凡是需要做分子生物学实验的lab,肯定逃不了要买一台核酸定量的机器。目前最为流行的仪器是nanodrop,只需滴加一两微升的样品,按一下按钮,利用核酸的紫外吸收特性,即可得到浓度数据。近几年,以qubit为代表的基于特异荧光染料法的仪器也逐渐进入科研人员的视野。那么,这两类仪器有什么区别,在使用时需要注意什么,如何根据实验室需求来选购?如下文所示。

首先我们需要来理解两台仪器在核酸定量原理上的区别。正如方才所言,nanodrop利用了核酸的紫外吸收特性。

nanodrop

检测方法原理为核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统,能吸收紫外光,rna和dna的紫外吸收峰在260nm波长处。一般在260nm波长下,每1ml含1μg rna溶液的光吸收值为0.022~0.024,每1ml含1μg dna溶液的光吸收值约为0.020,故测定未知浓度rna或dna溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便,迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质,则测光误差较大,故应设法事先除去。nanodrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测,它无法区分出dna、rna、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。尽管紫外吸收定量法是最常用的一种dna或rna定量方法,但其读数并不可靠,不能用于后续建库的参考。

qubit

qubit荧光计是新一代核酸和蛋白定量仪,实验台上可以对dna和rna进行精准定量,它可以采用荧光染料检测特定目标分子的浓度。它采用的是荧光检测技术,该技术采用与dna、rna或蛋白质结合后才发出荧光的molecular probes® 染料。这些荧光染料可以特异地与不同种类的核酸链相结合,并在特定波长光源的激发下,发出荧光。其中,结合了核酸的荧光染料,相比那些游离的,信号可增幅数十倍至数百倍,因此可以和背景区分开来。目前,做测序的实验室基本把qubit当标配仪器了。

虽然以nanodrop为代表的紫外吸收法在科研领域已经沿用了数十年,但由于原理上的限制,这一类仪器有无法避免的缺陷。

1、紫外吸收法无法区分dna和rna

这一点其实在原理上就很好理解了。如下图所示,具有紫外吸收的结构是核酸的碱基,而dna和rna均含有碱基,因此当一份样品同时含有dna和rna的时候,无论你本意是想测哪一个,均会高估其真实浓度。

而qubit的荧光染料法则避免了这个问题。只要采用dna、rna特异的染料,就能有选择性地测定样品中的核酸浓度。下图是qubit的官方测试数据。这个实验是在dna样品中混合入不同比例的rna,并用qubit法和紫外吸收法分别进行测定。当dna的样品足够纯时(dna:rna = 10:0),两种方法测得的数值并没有显著区别。但当混入的rna越来越多,紫外吸收的数值也跟着升高(蓝色和绿色柱子),而使用双链dna染料的qubit数值则没有改变(红色柱子)。使用rna染料用qubit进行测定,则会发现,随着rna混入的增加,读数也跟着升高。

目前,双链和单链dna、rna及蛋白质均有特异的荧光染料。也就是说,无需专门纯化样品,或者在未知污染程度的情况下,使用qubit可以方便地得知浓度信息。

2、紫外吸收法的定量限较高

对于任何仪器分析,都具备其检出限和定量限。nanodrop标称的检出限是2ng/µl(双链dna),然而定量限则远高于此。其他的nanodrop用户也有类似的体验,曾经在researchgate上看到说,低于50ng/µl的话就容易测不准,变异度会增大。以下同样是来自qubit的官方数据。当dna的浓度低于某个程度时,紫外吸收法的偏差和变异度就突破天际了。

qubit与紫外吸收法测定低浓度dna时的偏差及变异度比较

这两张图中,紫外吸收法得到的偏差和变异度在我看来已经算小的了,要低于4 ng/µl双链dna才会出现问题。然而在实际使用中,低于10甚至20 ng/µl时就比较容易出乱子。而pcr产物胶回收等应用,最终的实际浓度往往就落在这个容易测不准的范围内。

3、紫外吸收法对溶液的ph和盐浓度敏感 

在研究物质吸光度时,我们总要明确地定义缓冲液的离子强度以及ph,这就说明,吸光度本身是受到这两个因素影响的。

通常而言,偏酸的溶液,容易给出偏低的a260/a280数值。相反,偏碱的溶液则容易高估。相应地,也有报道称,当用水作为溶剂时,紫外吸收测定的数值变异度增大,而当使用tris或tris-edta溶液进行测定时,重复性就提高了。这其中的原因,很可能是空气中溶解入水中的co2浓度差异造成的。离子强度对于紫外吸收的影响比较复杂,这里不展开。

相比之下,荧光染料法对样品的污染和ph等的容忍度较大。

4、紫外吸收法对降解比较严重的核酸无能为力 

这一点,同样也是由紫外吸收原理的局限性所决定的。紫外吸收测定的对象是碱基,因此无论核酸是完整成链的,还是降解成单个游离核苷酸,该方法均无法加以区分。尽管我们可以通过a260/a280数值是否过大来估计核酸样品的降解状况,但却无法选择性地只测定那些结构完整的核酸的浓度。

而荧光染料通常结合的是核酸的链结构,并不会与游离的单核苷酸相互作用。不过话说回来,对于那些尚未降解成单个核苷酸而呈短链状态的核酸,荧光染料法是无法将其与完整核酸区分开来的。

结语

如果在实验中获得的核酸样品总是很纯净且均一(如原材料是容易对付的培养细胞,还用品质好的试剂盒进行抽提;而非奇奇怪怪的极端样品,还要是自己配的试剂),同时产量又很高,那紫外吸收法完全可以胜任,外加测定速度秒杀荧光染料法。此外,荧光染料法对温度比较敏感,比如上一回是在25℃室温制作并储存的标准曲线,而这一回要测定样品时实验室空调坏掉,一下子有了3℃以上的温差,那么标曲就得重新制作。同时,荧光染料要现用现配,样品至少要染2min,花费的时间比紫外吸收法要长。 

编辑:songjiajie2010

 
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