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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-03-15  来源:上海抚生实业有限公司
核心提示: pcr反应的关键因素主要有引物的选择与设计、酶的质量、模板的制备,在前二者都稳定可行的情况下,pcr模板的制备尤为重要。
 pcr反应的关键因素主要有引物的选择与设计、酶的质量、模板的制备,在前二者都稳定可行的情况下,pcr模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基本技能,决定分离模板核酸(dna或rna)的质和量及pcr的成败。而提高模板核酸质量的关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等)。除去抑制taq dna聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的产量。

传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如sds等来破坏细胞组份,溶解细胞膜,使蛋白质变性,再用蛋白酶k来消化去除蛋白质,尤其是与dna结合的蛋白质,再用酚:抽提,然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸,供pcr实验用。但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法。亦可满足pcr实验的要求。采用哪种方法消化 处理标本,视pcr实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定。

模板核酸的提取制备方法:

一、蛋白酶k消化裂解法:适用于所有标本的消化处理,尤以dna样品为佳。如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿,粪便等。

1、试剂配制

1)蛋白酶k消化液:

10mmol/l tris.cl(ph8.0)

10mmol/ledta

150mmol/lnacl

0.5%sds

100~200ug/ml蛋白酶k. 

2)蛋白酶k最好用水配成20mg/ml,临用时加入消化液中。 

2、提取方法: 

有些标本、在用蛋白酶k消化前,还需预处理一下,如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等,其方法有离心去掉杂质,脱蜡等。

临床标本或经预处理的标本加蛋白酶k裂解液50~100ul,混匀,55℃ 1~3小时, 或37℃过夜。加等体积的饱和酚抽提1~2次,再加等体积的:(49:1)抽提一 次,上清加入1/10体积的ph值5.23mmol/l醋酸钠缓冲液,加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h。取出后14000转/min离心15min。小心吸弃或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1~2次,特别小心的 吸弃或倒掉上清,真空或37℃温箱或室温干燥,加te缓冲液20ul溶解后,取3~8ul 用于pcr扩增,或放-20℃保存。 

蛋白酶k消化法除上述经典处理法外,亦可在蛋白k消化处理标本,经离心处理后,吸取上清经95~97℃或煮沸10min灭活蛋白酶k后,直接作核酸模板用于pcr扩增。如杂质较多,还可经酚:抽提后,即可用于pcr反应。此法蛋白质及其它杂质消除,taq酶活性不受影响,具有良好的重复性与稳定性。但操作繁复,技术要求高。

二、直接裂解法: 标本(组织细胞,分泌物)加pbs或生理盐水离心洗涤后,加消化 裂解液20~50ul(0.5%np-40和0.5%吐温-20),95~98℃,15~30min以裂解病原体,裂解细胞。然后12000r/min离心5~10min,取上清20~30ul用于pcr扩增。血清标本可 直加等体积的消化液,加热处理离心后pcr扩增。亦有用5%的np-40和1.5%2-me做裂解 液,95℃30min消化处理,离心取上清,pcr扩增检测hbv dna. 

三、碱变性法: 取血清20ul,加入1mol/l naoh 20ul,37℃30min,离心,加 1mol/l hcl 20ul,离心后,取上清5ul,用于pcr扩增。*亦有用10ul血清加naoh至 0.2mol/l,37℃1h,再加hcl中和离心后取上清10ul做pcr,其特异性和敏感性较前法 更好。 

四、煮沸法: 经离心洗涤过的组织细胞,分泌物及血液标本,加适量无菌蒸馏水或pbs,混匀 后,100℃煮沸10~15min,14000r/min 10min,取上清做pcr.

五、碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10~100ul,加等体积的6mnai,反复轻混20s,加等体积:(49:1)振匀后,离心取上清加0.6体积的异丙醇,混匀后 置室温3min。14000r/min 10min,沉淀加10~100ul,te溶解,取5~10ul做pcr,亦有用100ul血清加裂解液300ul(6m nai,0.5%十二烷基肌酸钠,10ug糖原,26mmol/l ph8.0 tris-hcl,13mmol/ledta)混匀后,60℃15min,加等体积异丙醇,离心沉淀后,加te液用于pcr扩增,其产量和质量较高。

六、异硫氰酸胍法 

此法主要用于rna的提取,标本为组织细胞及血清等。

1、异硫氰酸胍消化液

异硫氰酸胍4mol/l

柠檬酸钠(ph7.0)25mmol/l

十二烷基肌酸钠0.5%

β-巯基乙醇0.1mol/l

2、消化方法:用50~100ul细胞悬液及血清,加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀后,或65℃ 1小时,或室温放置数分钟,然后加1/10体积的3mmol/l ph5.2的醋酸钠缓冲液,再加等体积的酚,用力振摇约10s,10000r/min,离心5min,取上清加等 体积异丙醇-20℃放置3h后,14000r/min离心15min,沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1~2次,真空干燥,沉淀用te缓冲液溶解即可用于逆转录pcr扩增,或放-20℃保存。 

其它消化处理标本提模板核酸的方法有:

①异硫氰酸胍一二氧化硅法。

②异硫氰酸胍-玻璃粉法。

③chelex-100法。

④全血直接扩增法。

⑤尿素消化裂解法。 

各有千秋,可根据情况选用。


编辑:songjiajie2010

 
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