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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-02-19  来源:上海源叶生物科技有限公司
核心提示:    ① 凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时,凝胶板浸泡
    ① 凝胶类型 

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时,凝胶板浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。目前更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。

 

② 缓冲液系统 

缺少离子时,电流太小,dna迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和dna的变性。

 

常用的电泳缓冲液有edta(ph8.0)和tris-乙酸(tea),tris-硼酸(tbe)或tris-磷酸(tpe)等,浓度约为50mmol/l(ph7.5~7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液,临用时稀释到所需倍数。

 

tae缓冲能力较低,后两者有足够高的缓冲能力,因此更常用。tbe浓溶液长期贮存会出现沉淀,为避免此缺点,室温下贮存5×溶液,用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。

 

③ 凝胶的制备

以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水平胶框或垂直胶膜,插入梳子,自然冷却。

 

④ 样品配制与加样

dna样品用适量tris-edta缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生u形条带,可改用2.5%ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。

 

⑤ 电泳

琼脂糖凝胶分离大分子dna实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好。在低电压条件下,线性dna分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是,在电场强度增加时,较大的dna段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离dna段的zui大分辨率,电场强度不宜高于5v/cm。

 

电泳系统的温度对于dna在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4℃进行电泳。

 

⑥ 染色和拍照

常用荧光染料溴乙锭(eb)染色,在紫外光下观察dna条带,用紫外分析仪拍照,或用凝胶成像系统输出照片,并进行有关的数据分析。

编辑:songjiajie2010

 
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