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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-01-31  来源:网络
核心提示: depc(二乙基焦碳酸酯)(1)depc是rna酶的化学修饰剂,它和rna酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。(2)depc与
 depc(二乙基焦碳酸酯)

(1)depc是rna酶的化学修饰剂,它和rna酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

(2)depc与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

(3)试验所用试剂也可用depc处理,加入depc至0.1%浓度然后剧烈振荡10分钟再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的depc,否则depc也能和腺嘌呤作用而破坏mrna活性。

(4)但depc能与胺和巯基反应,因而含tris和dtt的试剂不能用depc处理。

实验步骤如下:

1. 取50~100mg的组织加入1 ml trizol试剂,用匀浆器打匀(trizol 先放于冰上)。

2. 将匀浆室温放置5 min。

3. 加入200 μl 氯仿剧烈震荡混匀30s,冰上静置3 min。

4. 12000 rpm,4℃ 离心15 min。

5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中(取400 μl ),加入等量体积的异丙醇,上下颠倒几次混匀,室温下放置15 min。(此步中留意:不要吸取任何中间层物质,宁缺勿滥。)

6. 12000 rpm,4℃ 离心15 min 。

7. 小心移去上清液,防止rna沉淀丢失。

8. 用70%乙醇(depc处理的水配制)洗涤1次,加入700 μl乙醇,将rna沉淀弹起,漂洗。(此时rna是不溶解的)

9. 8000 rpm,室温离心10min。

10. 尽可能彻底地吸走上清,防止rna沉淀丢失。

11. 真空离心干燥3~5分钟,或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

12. 沉淀用30 μl depc-h2o溶解。如发现沉淀难溶,68 ℃处理10 min。

13. rna检测

(1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1od=40 μg/ ml rna计算rna的产量。od260/od280在1.8-2.0 。

(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定rna的完整性和污染情况。

低得率:a.样品裂解或匀浆处理不彻底;b.最后得到的rna沉淀未完全溶解。

编辑:songjiajie2010

 
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