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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-01-30  来源:网络
核心提示:【目的】研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna质量的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分

【目的】
研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化
rna。rna质量的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。
【主要试剂】
trizol是一种新型总rna抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。

1. trizol试剂含有苯酚,具有毒性和刺激性,注重操作。

2. rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,注重配带手套,样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率,因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。

4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构,可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡,使细胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。
【预备工作】
rna酶(rnase)是导致rna降解最主要的物质。此酶非常稳定,在一些极端的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的rnase完全失活。

1.它广泛存在于人的皮肤上,因此制备rna时必须戴手套

2.rnase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以depc配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理

塑料制品:尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明rnase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理。

处理的步骤如下:

(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入depc使其终浓度为0.05%~0.1%(depc-h2o)。(depc二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物,须在通风橱中小心使用)

(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入depc-h2o,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。

(3)将depc-h2o小心倒入废液瓶中,将装有depc- h2o 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

(4)灭菌塑料制品烘烤干燥,置洁净处备用。

(5)玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上。

编辑:songjiajie2010

 
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