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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-01-29  来源:上海隆垒生物科技有限公司
核心提示:一、工作原理数字pcr无疑是pcr领域最激动人心的创新之一,这一技术的诞生让许多人定量的梦想成为现实。定量pcr和数字pcr都能实现


 

一、工作原理

数字pcr无疑是pcr领域最激动人心的创新之一,这一技术的诞生让许多人定量的梦想成为现实。定量pcr和数字pcr都能实现对样品中的核酸进行定量,它们之间的差别在于定量pcr依赖于标准曲线和参照基因,而数字pcr则能计数dna分子进行定量。在许多领域的研究中数字pcr都是难以取代的宝贵技术,包括检测罕见等位基因、在野生型背景下鉴定突变基因、区别低水平的拷贝数变异、验证二代测序结果和基因表达分析等。
   数字pcr的基本工作原理很简单,先将样品划分为多个pcr反应,每个反应最多只含有一个目标分子,然后用荧光标记的探针进行检测,计数含有目标分子的反应。正因如此,数字pcr不需要标准曲线,就可以真正实现对样品的定量。不过,这并不意味着dpcr就永远是的选择。“尽管数字pcr能够定量,其工作流程也比传统qpcr简单得多,但数字pcr的通量比较低,”fluidigm公司的分子生物学主管ramesh ramakrishnan说。“总的来说,传统qpcr通量更高,而数字pcr的灵敏度和性更好。在寻找罕见突变时数字pcr尤其适用。”
二、分液带来的高精度

样品分液(partitioning)是决定数字pcr性的最重要因素之一。数字pcr通过分液将样品分成小份,通常每一份最多只含有一个拷贝的目标核酸。荧光标记的探针可以用来揭示目标核酸存在与否,并由此获得初始样品中的分子数。“数字pcr这种方法非常简单,一个阳性信号代表着一个目标分子,而没有信号就意味着目标不存在。”ramakrishnan说。

life technologies公司的taqman® openarray® 数字pcr试剂盒可以在openarray® 平板上运行,openarray® 平板是一种不锈钢的微流体平板,只有显微镜载玻片大小。这种平板的表面刻有3,072个通孔,每一个通孔都是一个独立的pcr反应孔。每块平板上的通孔排列形成48个子阵列,每个子阵列含64个通孔。openarray® 平板的外表面由疏水包被,而通孔内部是亲水包被,由此分隔各通孔中的样品,使其无法彼此接触和混合。

openarray® 平板可以在life technologies的openarray® 实时定量pcr系统和quantstudio™ 12k flex 上使用。quantstudio™ 12k flex dpcr仪能支持96孔或384孔板、taqman® array卡片和中等密度的openarray平板。“quantstudio™ 12k flex dpcr仪能够同时运行四个openarray平板,一次性生成12,228个单独的pcr循环,并且实时收集pcr扩增的数据,”life technologies公司的qpcr资深产品iain russell说。“openarray数字pcr平板的开放性,使研究者们可以根据自身需要,对反应的重复数进行调整,在通量、性能和实验成本之间达到平衡。你可以每种样品只使用一个子阵列,这样运行一次就可以得到192个数字pcr结论。或者你也可以一种样品运行四个平板(192个子阵列),使系统性能和可重复性最大化。”

fluidigm和life technologies采用微流体芯片和微流体通道进行数字pcr。与此不同的是,bio-rad选择将样品分为微小的液滴,raindance technologies随后也加入了这一行列。“我们的*优势在于,可以将样品分为1纳升液滴,这些液滴的一致性和可重复性都非常好。通过这一技术,我们可以将每个样品分为20,000个液滴,” kurtz说。其他系统的分液数量大多在760到3,000之间,“分液数量越多可以使分析更为。”由于分液更多,在bio-rad的系统中每个液滴能容纳多至五个目标,大大提高了检测的动态范围。“我们的系统可以解析1至100,000个目标拷贝,因此不需要在运行数字pcr之前对样品进行系列稀释,”kurtz补充道。


编辑:songjiajie2010

 
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