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放大字体  缩小字体 发布日期:2010-12-24
核心提示:pcr技术的基本原理

⑴pcr技术的基本原理:该技术是在模板dna、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于dna聚合酶的酶促合成反应。dna聚合酶以单链dna为模板,借助一小段双链dna来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链dna模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,dna聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-oh末端,并以此为起始点,沿模板5´→3´方向延伸,合成一条新的dna互补链。

pcr反应的基本成分包括:模板dna(待扩增dna)、引物、4种脱氧核苷酸(dntps)、dna聚合酶和适宜的缓冲液。类似于dna的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板dna的高温变性:模板dna经加热至93℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板dna与引物的低温退火(复性):模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板dna单链的互补序列配对结合;③引物的适温延伸:dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

⑵pcr的反应动力学: pcr的三个反应步骤反复进行,使dna扩增量呈指数上升。反应最终的dna 扩增量可用y=(1+x)n计算。y代表dna片段扩增后的拷贝数,x表示平(y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期,靶序列dna片段的增加呈指数形式,随着pcr产物的逐渐积累,被扩增的dna 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期, 即出现“停滞效应” ,这种效应称平台期数、pcr 扩增效率及dna聚合酶pcr的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

⑶pcr扩增产物 :可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中, 以两条互补的dna为模板,引物是从3'端开始延伸, 其5'端是固定的,3' 端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时, 由于新链模板的5'端序列是固定的, 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点, 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加, 而“长产物片段”则以算术倍数增加, 几乎可以忽略不计, 这使得pcr的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯dna片段供分析与检测用。

 

编辑:songjiajie2010

 
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