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放大字体  缩小字体 发布日期:2010-11-17  来源:丁香通
核心提示:dna序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今dna序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是abi prism 310型dna测序仪的测序原理和操作规程。

dna序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今dna序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是abi prism 310型dna测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 
abi  prism 310型基因分析仪(即dna测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法),因此通过单引物pcr测序反应,生成的pcr产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链dna混合物,使得四种荧光染料的测序pcr产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在ccd摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为dna序列,从而达到dna测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定dna片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子聚合物,包括dna测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的ccd摄影机检测器,使dna测序缩短至2.5h,pcr片段大小分析和定量分析为10~40min。
由于该仪器具有dna测序,pcr片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行dna测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析,临床上可除进行常规dna测序外,还可进行单核苷酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
【试剂与器材】
1.bigdye测序反应试剂盒  主要试剂是bigdye mix,内含pe专利四色荧光标记的ddntp和普通dntp,amplitaq dna polymerase fs,反应缓冲液等。
2.pgem-3zf ( ) 双链dna对照模板  0.2g/l,试剂盒配套试剂。
3.m13(-21)引物  tgtaaaacgacggccagt,3.2μmol/l,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。
4.dna测序模板  可以是pcr产物、单链dna和质粒dna等。模板浓度应调整在pcr反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒dna,浓度为0.2g/l,即200ng/μl。
5.引物  需根据所要测定的dna片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/l,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如m13(-21)引物,t7引物等。
6.灭菌去离子水或三蒸水。
7.0.2ml或和0.5ml的pcr管  盖体分离,pe公司产品。
8.3mol/l 醋酸钠(ph5.2)  称取40.8g naac•3h2o溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调ph至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。
9.70%乙醇和无水乙醇。
10.naac/乙醇混合液  取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混匀,室温可保存1年。
11.pop 6测序胶  abi产品。
12.模板抑制试剂(tsr)  abi产品。
13.10×电泳缓冲液  abi产品。
14.abi prism 310型全自动dna测序仪。
15.2400型或9600型pcr仪。
16.台式冷冻高速离心机。
17.台式高速离心机或袖珍离心机。
【操作步骤】
1.pcr测序反应
(1) 取0.2ml的pcr管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂                           测定模板管          标准对照管
bigdye mix                             1μl                        1μl
待测的质粒dna                     1μl                         -
pgem-3zf ( ) 双链dna        -                        1μl
待测dna的正向引物             1μl                         -
m13(-21)引物                        -                        1μl
灭菌去离子水                         2μl                       2μl
总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧pcr管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2)  将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环,pcr循环参数为96℃ 10s,50℃ 5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
2.醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物
(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml ep管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。
(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。
3.电泳前测序pcr产物的处理。
(1) 加入12μl的tsr于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解dna沉淀,稍离心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中,稍离心。
(3) 在pcr仪上进行热变性(95℃ 2min),冰中骤冷,待上机。
4.上机操作  按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kv预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kv,20min),在7.5kv下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
【计算】
测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括n数)/650×100%差异碱基即测定的dna序列与已知标准dna序列比较不同的碱基,n为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1.abi prism 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
2.本实验测序pcr反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以pcr管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧pcr管盖外,最好选用pe公司的pcr管。如pcr结束后pcr液小于4~4.5μl,则此pcr反应可能失败,不必进行纯化和上样。
3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的dna样品和引物,一个测序pcr反应使用的模板不同,需要的dna量也就不同,pcr测序所需模板的量较少,一般pcr产物需30~90ng,单链dna需50~100ng,双链dna需200~500ng,dna的纯度一般是a260nm/a280nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解dna,不用te缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4.本实验使用的测序试剂盒是bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测dna长度为650bp左右。本仪器dna测序精确度为(98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基n<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于n碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
编辑:songjiajie2010

 
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