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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-01-26
核心提示: rt-qpcr检测定量逆转录pcr(quantitative reverse transcription pcr,rt-qpcr)是应用于以rna作为起始材料的pcr实验中的一
 rt-qpcr检测

定量逆转录pcrquantitative reverse transcription pcr,rt-qpcr)是应用于以rna作为起始材料的pcr实验中的一种实验方法。在该方法中,总rna或信使rna(mrna)首先通过逆转录酶转录成互补dna(cdna)。随后,以cdna为模板进行qpcr反应。rt-qpcr已被用于多种分子生物学的应用中,其中包括基因表达分析、rna干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

 

rt-qpcr的一步法与两步法

rt-qpcr可通过一步法或两步法来完成。一步法rt-qpcr把逆转录与pcr扩增结合在一起,使逆转录酶与dna聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法rt-qpcr只需要利用序列特异性引物。在两步法rt-qpcr中,逆转录和pcr扩增过程是在两个管中完成,使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

 

一步法

优点:

1. 由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差;

2. 更少的移液步骤能够减少污染的风险;

3. 适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高。

缺点:

1. 无法分别对两步反应进行优化;

2. 由于反应条件是结合两步反应折中得到的,因此灵敏性不如两步法;

3. 单一样品检测的靶点数较少。

 

两步法

优点:

1.能够建立可以长期保存,并用于多次反应的稳定的cdna库;

2. 靶基因和内参基因能够从同一个cdna库进行扩增,而不需要多重cdna库;

3.能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件;

4. 灵活的引发条件选择。

缺点:

1. 使用多个试管,以及更多的移液步骤会增加dna污染的风险,并且耗时;
2. 相较于一步法,需要进行更多的优化。

 

 

编辑:songjiajie2010

 
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