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放大字体  缩小字体 发布日期:2024-01-15  来源:上海抚生实业有限公司
核心提示: rt-pcr就是逆转录pcr(reverse transcription pcr)或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr),是聚合酶链式
 rt-pcr就是逆转录pcr(reverse transcription pcr)或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr),是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr中,一条 rna 链被逆转录成为互补dna,再以此为模板通过pcr进行dna扩增。逆转录(reverse transcription)是以rna为模板合成dna的过程,即rna指导下的dna合成,逆转录实验包括3大要素,分别是引物、逆转录酶和rna模板:
1. 引物:逆转录引物主要有3种,包括 oligo(dt)、random primers和基因特异性引物(gsp)。其中oligo(dt)具有12-20个t碱基,并且与真核生物mrna的3’poly a尾配对,可合成全长的cdna,但仅扩增有polya尾的mrna ,对模板质量要求高,较适合克隆实验。而random primers具有6-9个碱基,可随机识别模板并结合,适合复杂结构和微量模板,但特异性低,小片段多,适合后续qpcr实验。基因特异性引物可以识别特定模板序列,具有特异性强,灵敏度高的特点,但需合成特定的序列。所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。
2. 逆转录酶:一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(amv),由两条肽链组成,具有聚合酶活性和很强的rnaseh活性,它最适温度是42℃,最适ph8.3,在高反应温度时可消除 mrna的二级结构对逆转录的阻碍,然而高水平的rnaseh的活性既抑制cdna产生也限制其长度。另一种来源于鼠白血病病毒(m-mlv),是单肽链的,有rna聚合酶活性和相对较弱的 rnaseh活性,最适温度37℃,最适ph7.6,较弱的rnaseh活性对获得2-3kb的mrna的全长cdna有很大好处。
3.rna模板:通常利用紫外分光光度计检测纯度,要求a260/280=1.9~2.1,
a260/230=2.0~2.2。利用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整度,完整的总rna在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的28s和18s rrna条带(真核样品),28s rrna条带的强度应当大致为18s rrna条带的两倍,并且无gdna和蛋白残留。

编辑:songjiajie2010

 
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